导读
革兰氏阳性菌肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）经常定植在人的咽部，通常会侵入无菌的身体部位引起侵入性肺炎球菌病（IPD），包括菌血症、菌血症性肺炎、脑膜炎。IPD是世界范围内发病和死亡的主要原因，而肺炎球菌性脑膜炎是IPD中更为严重的一种，具有高的死亡和永久性神经后遗症风险。肺炎链球菌的突变有时会引起脑膜炎，增加对脑膜炎相关的肺炎链球菌突变的了解，可以提高人们对发病机制的理解，并为预防策略提供信息。本文报告了IPD病人测试队列（n=）、独立的验证队列（n=）中，肺炎链球菌pbp1b基因突变（pbp1bAC突变引起PBP1b转糖基酶结构域NT突变）与脑膜炎的发生有关。感染pbp1bAC突变型肺炎链球菌的病人得脑膜炎的概率是感染非pbp1bAC突变型肺炎链球菌的病人的2.8倍。pbp1bAC的突变导致抗生素治疗杀死细菌需要更长的时间。因此，在IPD患者中，肺炎球菌突变导致抗生素耐受性增加与脑膜炎有关。
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文献ID
题目：侵入性肺炎链球菌的基因组关联分析确定了一种与脑膜炎相关的错义突变
译文：Genome-wideassociationanalysesofinvasivepneumococcalisolatesidentifyamissensebacterialmutationassociatedwithmeningitis
期刊名：NatureCommunications
年份：IF：11.
通讯作者：YuanLi
单位：国家免疫和呼吸疾病中心，疾病控制和预防中心，美国
材料与方法
测序方法：Illumina全基因组测序
测序深度中位值：测试队列：×验证队列：×
研究成果
1、测试队列概况
测试队列分离株可以广泛地代表监测地区从年到年肺炎链球菌的基因组多样性，（6.8%）个分离株来自脑膜炎患者，（93.2%）个分离株来自非脑膜炎的IPD病人（表1）。与其他年龄相比，2和5-17岁IPD的患者有较高频率的脑膜炎。包括7种血清型的七价肺炎球菌结合疫苗（PCV7）以及包括额外6种血清型的十三价肺炎球菌结合疫苗（PCV13）组比非PCV13组脑膜炎发生率低。脑膜炎病例与样本年份或青霉素敏感性均无关。
表1测试队列中侵入性肺炎球菌的特征
表2验证队列中侵入性肺炎球菌分离株的分析
测试队列分离株的全基因组测序和重头组装鉴定出7,个CDS序列的同义突变SNP，以及10,个CDS序列的能引起氨基酸改变（AAVs）的非同义突变SNP，个基因存在缺失或变异（GAPs）。所有的AAVs和GAPs（n=）采用线性混合效应模型（LMM）评估与脑膜炎的关系（图1a）。模型用FaST-LMM软件进行拟合，鉴定了P值最低的AAV作为候选变异（P=6.8×10–6，图1b），通过Bonferroni校正后P值为0.08。第二低的P值（P=2.2×10–4）是候选变异的31倍，且Bonferroni校正后不显著。使用GEMMA软件也得到相同的结果。候选变异（pbp1bC）使pbp1b基因序列（SP_）位从A变成C，从而青霉素结合蛋白（PBP）1B的转糖基酶结构域从天冬氨酸N变异成苏氨酸T。在测试队列，16.5%（23）脑膜炎病人和6.4%（）的非脑膜炎病人受pbp1bC型肺炎球菌感染。在个非pbp1bC型分离株中，pbp1b的位点98%（）是A，2%（33）缺失。
pbp1b基因在20个肺炎球菌参考基因组中是保守的，两侧始终分别是一个假设的蛋白基因（SP_）和酪氨酸tRNA合成酶基因（tyrS）（图1c）。邻近位点的变异与脑膜炎无显著相关性，与候选变异的连锁不平衡程度较低（图1d）。
图1测试队列肺炎球菌变异与脑膜炎的关系
2、验证队列
验证队列包括年1月1日至12月31日期间活菌监测中心（ABCs）IPD病例中所有可用的侵入性分离株（n=），占十个监测点IPD病例中的85.6%。脑膜炎分离株的比例（7.1%）与测试队列相似。验证队列患者以成人（≥18岁）为主，以感染非PVC血清型肺炎球菌为主（图2a）。年龄和血清型分布显示了当前IPD流行病学，与测试样本中观察到的结果有很大不同，说明该队列是独立的。
验证队列的研究主要目的是评估pbp1bC是否与IPD患者更高的脑膜炎概率有关，次要目标包括：(1)鉴定其他的候选变异，(2)量化不同亚组中与pbp1bC相关的脑膜炎风险增加，(3)描述pbp1bC基因型在人群中的分布。
验证队列分离株的全基因组测序和重头组装鉴定出16,个CDS序列的同义突变SNP，以及17,个CDS序列的能引起氨基酸改变（AAVs）的非同义突变SNP，个基因存在缺失或变异（GAPs）。所有的AAVs和GAPs（n=19,）采用LMM评估与脑膜炎的关系（图2b）。模型用FaST-LMM软件进行拟合，发现候选变异pbp1bC与脑膜炎显著相关（P=2.28×10–6）（图2c）。使用GEMMA软件也得到相同的结果。与pbp1b基因相邻位点的变异与脑膜炎无显著相关性，与pbp1b位点的连锁不平衡程度较低（图2d）。在该队列中，23.6%(42)脑膜炎病人和10.6%()的非脑膜炎病人受pbp1bC型肺炎球菌感染。在个非pbp1bC型分离株中，pbp1b的位点是99.8%()是A，0.2%(4)缺失。
图2验证队列肺炎球菌变异与脑膜炎的关系
3、pbp1bC突变的功能影响
pbp基因家族涉及肺炎球菌对β-内酰胺抗生素的耐药性形成。耐药性形成的主要因素是PBP1a、PBP2b和PBP2x蛋白的变化，这些变化导致对抗生素的亲和性降低。为了探究pbp1bC突变对β-内酰胺耐药性的潜在作用，验证队列分离株检测了对6种β-内酰胺抗生素（常用的治疗肺炎球菌感染药物，青霉素、阿莫西林、美罗培南、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛）的最低抑菌浓度（MIC）。株pbpC临床分离株和株非pbpC临床分离株分别获得和个MIC值，其中10个分离株缺失了60个MIC值。六种抗生素的MIC值高度相关，两两相关性在0.84到0.95之间。pbpC分离株和非pbpC分离株对美罗培南(0.06μgml?1)、头孢噻肟(0.06μgml?1)和头孢呋辛(0.5μgml?1)的MIC中位值相等(图3a)，而pbpC分离株对青霉素(0.25vs0.06μgml?1)、阿莫西林(0.06vs0.03μgml?1)和头孢曲松钠(0.06vs0.03μgml?1)的MIC中位值高于非pbpC分离株（图3）。仅青霉素的MIC中值的差异就超过了稀释倍数的两倍，但是具有相同多位点序列类型（multi-locussequencetype,MLST)的pbpC和非pbpC分离株对青霉素的MIC相同（图3b），说明pbpC突变可能与β-内酰胺耐药性有关，但不是导致MIC升高的充分原因。
通过分析青霉素MIC线性混合效应模型，结合对pbp1bC的固定效应和基于全基因组SNPs的群体结构随机效应，发现pbp1bC对MIC的增加没有独立的贡献。相比之下，已知的与β-内酰胺耐药性相关的PBP改变（PBP2XTA,RG和LV）显示出与青霉素MIC升高的高度显著相关（图3c）。类似的结果也在其他五种β-内酰胺抗生素中观察到。因此，pbp1bC突变不太可能导致β-内酰胺耐药表型。
图3pbp1bAC对临床分离株耐药性的影响
为了进一步探索pbp1bC基因型的生物学效应，构建了一对同源实验室菌株R6和R6_C(图4a)。亲本R6菌株中的pbp1bA等位基因被pbp1bC等位基因所取代，从而得到了候选变异的R6_C菌株。全基因组测序证实了pbp1b等位基因序列的突变。R6和R6_C对抗生素的MIC值相当，青霉素（图4b,0.μgml?1）和17种其他用于IPD的抗生素，A到D的突变没有产生耐药性。接下来，通过估计杀死人群中99%的细菌所需的青霉素治疗持续时间（MDK99），比较了R6和R6_C的抗生素耐受性水平。在3μgml?1青霉素（倍MIC）中，R6_C菌株与R6相比表现出显著的死亡速度降低（图4c）。R6_C菌株的MDK99估计为±57min（平均值±SD；图4d），明显长于亲本R6菌株（±68min；P0.；图4d）。
图4pbp1bAC对同基因菌株抗生素耐药性和耐受性的影响
4、pbp1bC突变的效应大小估计
使用混合效应逻辑回归模型估计了pbp1bC对脑膜炎的影响大小，该模型明确地说明了肺炎球菌表型与毒力（血清型和抗生素耐药性）可能有关。
将模型拟合到验证队列，脑膜炎患者中感染pbp1bC肺炎球菌比感染非pbp1bC肺炎球菌的校正优势比（aOR）为2.83。与18-64岁的患者相比，小于2岁的患者患脑膜炎的风险更高（aOR=1.97），而大于64岁的患者患脑膜炎的风险更低（aOR=0.46）。得出的结论是，pbp1bC似乎是IPD患者得脑膜炎的独立预测因子，其效应大小与患者年龄相当。
接下来，分析pbp1bC和脑膜炎之间的关联是否由特定的流行病学亚群驱动（图5）。按患者年龄范围和监测地点（州）对分离株进行分层，利用上述混合效应逻辑回归模型对各层的pbp1bC的效应大小进行估计。在5-17岁和大于64岁的患者中（图5a），以及俄勒冈州和康涅狄格州以外的其他州（图5b），这种相关性有增强的趋势。然而，没有证据表明pbp1bC效应大小在亚组间存在显著差异（所有F检验P0.05），表明SNP与年龄或监测位点之间缺乏相关性。
图5验证队列中pbp1bC基因型对脑膜炎综合征的影响
5、pbp1bC等位基因的分布
本研究检测的IPD分离株中，有9.5%（例）存在pbp1bC等位基因。该等位基因广泛分布于18个血清型和54个MLST。具有高比例pbp1bC等位基因的血清型为5(6/6)、10A(69/82)、23A(/)、23B(/)、11A(74/)、10F(2/2)和23F(22/58)。使用年ABCsIPD分离株，根据不同疫苗、患者年龄和地理位置的血清型，估计当前pbp1bC的分布情况。在这个队列中，有个分离株(11.5%)携带pbp1bC等位基因，其中绝大多数等位基因(/)在个非PCV13血清型分离株中发现。超过三分之一的pbp1bC(/)在株血清型包括在23价肺炎球菌多糖疫苗(PPSV23)中的分离株中发现。年龄2、2-4、5-17、18-64、64岁患者pbp1bC频率分别为0.16、0.22、0.12、0.11、0.11，差异无统计学意义（Fisher精确检验，P=0.）。10个州的pbp1bC等位基因的频率分别为0.06(NM)、0.07(CA)、0.09(CO)、0.09(MN)、0.13(CT)、0.13(TN)、0.14(MD)、0.14(NY)、0.14(OR)和0.15(GA)。
研究结论
1、感染pbp1bAC突变型肺炎链球菌的IPD病人得脑膜炎的概率升高；
2、在IPD患者中，肺炎球菌pbp1bAC突变与菌的抗生素耐受性增加有关；
3、鉴定了pbp1bAC突变型肺炎球菌的流行病学分布。
亮点
对IPD患者中分离出的肺炎链球菌进行全基因组测序，通过SNP和线性混合效应模型分析，鉴定出与脑膜炎相关的基因突变，大规模的测试队列和验证队列数据共同支撑了结论。且通过分子生物学实验构建突变菌株，直接证明了pbp1bAC突变对菌耐受性升高的影响。
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供稿：刘婷
编辑：鲁淑妮
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