导读

病原感染、免疫、肿瘤和中毒等多种原因均可导致慢性脑膜炎，因而临床上对于慢性脑膜炎的最终诊断往往要花费数周或数月的检测，甚至最后仍未确诊。这种情况往往就会造成无效甚至有害的经验性治疗。与传统的针对特定微生物或感染类别的检测不同，新一代脑脊液(CSF)或脑组织宏基因组测序(mNGS)可筛查几乎所有潜在的中枢神经系统(CNS)感染，并可识别新的或意想不到的病原体。目前mNGS已经开发出多种计算算法和分析流程，用于快速识别样本中存在的病原微生物序列。基于此，加州大学旧金山分校威尔神经科学研究所神经内科MichaelR.Wilson团队，在《JAMANeurology》上发表了利用宏基因组二代测序进行慢性脑膜炎的相关研究，建立了一个基于z分数的评分算法，用于区分真正的病原体和样品污染微生物序列，同时分享了临床案例并评估了mNGS在慢性脑膜炎中的应用效能。

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文献ID

英文题目：ChronicMeningitisInvestigatedviaMetagenomicNext-GenerationSequencing

中文题目：利用宏基因组二代测序研究慢性脑膜炎

发表期刊：JAMANeurology

见刊时间：.04.16IF：12.

发表单位：加州大学旧金山分校威尔神经科学研究所神经内科

材料与方法

本研究首先收集了94例非感染性神经炎性疾病患者的脑脊液、24例水和试剂对照样品进行mNGS分析，以这些样本的数据开发并建立了一种基于物种和属水平上的z分数的加权评分指标，以对mNGS结果进行优先级排序，用于后续区分真正的病原体和样品污染微生物序列。随后，收集了年9月-年3月之间招募的7名亚急性或慢性脑膜炎患者的脑脊液样本，提取了总RNA进行mNGS分析。7名患者分别来自加利福尼亚大学旧金山医学中心（n=2）、医院和创伤中心（n=2）、克利夫兰诊所（n=1）、华盛顿大学（n=1）和KaiserPermanente（n=1）。加权的z得分用于过滤掉环境污染物以帮助进行有效的数据分类和分析。

图1.病原检测分析流程

研究成果

7名慢性脑膜炎患者的年龄介于10-55岁之间，其中3名参与者（43％）是女性。表1给出了7名参与者其他临床特征。在每一位患者中，通过算法确定了得分最高的2个微生物，均鉴定到病原体（图2）。接下来，详细介绍7名患者的案例情况。

表1.7名参与者的临床特征

图2.分别对7名参与者统计评分结果进行排序

1、案例描述-有钩绦虫

参与者1为一名来自中美洲的28岁男子，患有头痛和复视。脑脊液（CSF）样本检测结果显示：白细胞(WBC)计数/μL，包含89%的淋巴细胞、4%的中性粒细胞、4%的单核细胞和3%的嗜酸性粒细胞；红细胞(RBC)的计数/μL；总蛋白水平的43mg/dL；葡萄糖水平为27mg/dL。脑磁共振成像(MRI)显示增强的基底脑膜和几个脑神经（图3A）。血清囊虫病抗体检测结果呈阳性，脑MRI未见囊泡或钙化。另外，低脑脊液葡萄糖水平、基底膜脑膜炎、结核菌素皮试阳性、结核菌素-伽玛释放试验阳性，促使给予该患者结核分枝杆菌(TB)脑膜脑炎的经验性治疗。

在接下来的3周内，病人的临床症状有所改善，但随后恶化，进行多次腰椎穿刺(LPs)、核磁共振成像(MRI)检查，并在接下来的一年里住院治疗。随后的CSF样本显示淋巴细胞增生恶化，持续低血糖和蛋白水平升高。神经影像学结果显示持续的基底膜炎和交流性脑积水，同样没有囊肿。尽管接受了结核病治疗，病人的情况仍然恶化，因而被怀疑为耐多药结核病。在第四次情况继续恶化（脑积水恶化、探讨脑室-腹腔分流管的放置）后，患者再次入院接受新的检测，同时经验疗法扩大到包括抗蠕虫的治疗。

患者的CSF样本进行了mNGS分析，结果显示没有检测到与分枝杆菌一致的序列。反而检测到个非人类Reads数比对到带绦虫属（表2），其中绝大多数序列为有钩绦虫（Tsolium）基因组。同时送检真菌18SrRNA聚合酶链反应(PCR)的CSF标本意外扩增到了Tsolium18SrRNA基因，CSF囊虫病IgG抗体检测结果阳性。经过8个月的抗寄生虫治疗，他的临床症状改善到基线水平。

图3.参与者1与参与者2的神经影像图

参与者2为一名34岁的妇女，13年前从中美洲移民到美国。她的症状表现为右侧头痛9个月，左侧面部麻木，右侧搏动性耳鸣，反复意识丧失。脑MRI显示脑积水、右前颞叶及前囊肿（图3B）。CSF检测结果显示：白细胞计数/μL，包括1%的中性粒细胞、31%的单核细胞、46%的淋巴细胞、21%的血浆淋巴细胞和1%的嗜酸性粒细胞；红细胞计数/μL、葡萄糖水平的不到10mg/dL、总蛋白质含量89mg/dL。经脑脊液、血清囊尾蚴IgG抗体检测结果呈阳性，给予阿苯达唑、强的松治疗1个多月。

然而，随后患者的颈部疼痛加剧，反复进行脑脊液检查显示，颅内压升高，胞饮增多，嗜酸性粒细胞增多，葡萄糖水平无法检测，总蛋白水平升高。后续CSFmNGS分析显示：检测到个Reads数（表2），与带绦虫属一致（图2）。最终该患者接受双重抗蠕虫治疗和辅助糖皮质激素治疗，临床反应良好。

表2.7名参与者的宏基因组测序结果总结

2、案例描述-新型隐球菌

参与者3为一名52岁的男性，有偏头痛病史，年诊断为HIV-1感染。另还有注射用药史、丙型肝炎病毒感染史、金黄色葡萄球菌心内膜炎史和梅毒史。症状表现为激动、混乱和共济失调。由于患者先前的金黄色葡萄球菌菌血症、梅毒、偏头痛病史和免疫抑制状态，鉴别诊断比较广泛。其CSF样本经mNGS分析，结果显示个独特的Reads数（表2），与隐球菌属序列一致，几乎所有的序列都与新生隐球菌一致。同时，血清隐球菌抗原检测结果阳性，滴度大于1:；CSF隐球菌抗原检测结果阳性，滴度大于1:。脑脊液真菌培养后，也培养出新型隐球菌。除了丙型肝炎病毒外，其他病原体均未通过CSFmNGS（图2）或标准诊断化验方法鉴定。患者在抗链球菌治疗的基础上，症状得到了改善。

3、案例描述-复发性脑病，已知感染HIV-1

参与者4为一名55岁的男子，他在8年前就被诊断出未经治疗的HIV-1感染。首次就诊于急诊科，出现了2周的神志不清，语言输出量下降，并伴有数月的咳嗽，间歇性盗汗和体重减轻；CD4计数为6个cell/μL。脑部MRI显示双侧融合性白质T2过度增强。脑脊液检查显示：白细胞和红细胞计数均为0/μL，葡萄糖水平为34mg/dL，总蛋白水平为93mg/dL。脑脊液mNGS检测结果显示超过个与HIV-1一致的独特的Reads数（表2，图2）。同时整个HIV-1基因组的平均总阅读覆盖率为。未检测到JC病毒，疱疹病毒或真菌病原体的序列。他的临床病程与HIV-1痴呆症一致，并且经过大量检测未发现条件性中枢神经系统感染。

4、案例描述-米曲霉

参与者5为一名32岁男性，因7个月的发作性头晕、复视、头痛、左侧面部麻木和无力而被送往急症室。他有注射吸毒和丙型肝炎病毒感染史。HIV-1检测结果为阴性。脑MRI显示左侧脑桥、小脑中叶、右侧垂体后叶漏斗部增强。计算机断层血管造影显示后循环有多处局灶性狭窄。脑脊液检查显示白细胞计数的/μL，包括77%的淋巴细胞、13%的中性粒细胞、6%的单核细胞和4%的活性淋巴细胞；红细胞计数为0/μL、总蛋白质含量61mg/dL、葡萄糖水平的45mg/dL。血液和脑脊液的细菌、真菌培养试验结果为阴性。他曾因怀疑存在自身免疫疾病而接受糖皮质激素治疗。

两周后，病人的症状恶化了。重复的脑磁振造影发现右侧丘脑有新的点状梗塞。反复脑脊液检查发现多细胞增生加重，以中性粒细胞为主。细菌培养呈阴性。脑脊液曲霉半乳甘露聚糖检测结果为11.26。第三次脑脊液检查结果显示更明显的脑脊液细胞增多，白细胞计数为/μ，包括63%的淋巴细胞组成、20%的中性粒细胞、15%的单核细胞和2%的活性淋巴细胞。脑脊液中曲霉半乳甘露聚糖的检测结果保持在7.23。同时脑脊液mNGS分析显示，个reads数比对到曲霉属（表2），其中大部分reads数比对到米曲霉(Aspergillusoryzae)。CSF18SrRNAPCR结果也为曲霉菌属阳性。未发现免疫缺陷的原因，也未发现全身性曲霉菌感染。开始口服伏立康唑治疗，脑积水采用脑室-腹腔分流治疗。

5、案例描述-荚膜组织胞浆菌

参与者为一个10岁的女孩，她的童年是在中西部度过的。她在西北地区出现了6个月的背部疼痛和10天的进行性左侧面部下垂、头痛、颈部疼痛和呕吐。经检查，发现她有严重的脑膜炎。脑和脊髓MRI表现为弥漫性软脑膜增强。脑脊液检查发现白细胞计数为/μL，包括33%的中性粒细胞和大于30%的单核细胞；红细胞计数/μL、血糖水平低于20mg/dL、总蛋白水平的mg/dL。针对细菌性脑膜炎、单纯疱疹病毒和地方性真菌病，开始了经验疗法。

随后该患者出现了呼吸衰竭和半身不遂。重复的神经影像学结果显示新的桥脑梗死和贯穿颈胸髓的非增强的纵向T2高信号。因此，将其治疗范围扩大到结核性脑膜炎。真菌培养和18SrRNAPCR结果显示，脑脊液中含有荚膜组织胞浆菌（Hcapsulatum）。mNGS检测结果显示33个reads数比对到荚膜组织胞浆菌（表2，图2）。经过2个月的治疗，该患者可以行走，但仍然有严重的左侧听力丧失、面部无力和神经性膀胱功能障碍。

6、案例描述-杜氏假丝酵母

参与者7为一名26岁的女性，最初有注射药物使用史，但未公开。该患者出现了1年的非创伤性腰痛，随后出现鞍状麻醉和左脚下垂的亚急性发展。MRI结果显示一个环状强化集合从腰椎顶部向前延伸，压迫脊髓圆锥，压迫后壁，同时弥漫性轻脑膜炎累及整个脊髓和脑干（图3C-E）。脑脊液样本白细胞计数显示/μL，包括67%的中性粒细胞、22%的淋巴细胞和11%的单核细胞；红细胞计数的/μ、总蛋白质含量mg/dL、葡萄糖水平的40mg/dL。广泛的感染性疾病诊断检测没有发现病原体，11周后病人接受了腰椎脑膜活检。病理结果显示为非炎性致密纤维组织，未发现微生物。与病理结果一致，经18SrRNA、16SrRNAPCR和mNGS检测，活检标本未见活动性感染。此外，脑脊液18SrRNAPCR检测结果也呈阴性。

三个月后，病人需要使用轮椅。重复脑脊液样本检测，显示白细胞计数显示/μL，包括81%的中性粒细胞、16%的淋巴细胞、2%的单核细胞和1%的嗜酸性粒细胞；红细胞计数/μL、总蛋白质含量mg/dL、葡萄糖水平44mg/dL。脑脊液mNGS结果显示：68个Reads比对到念珠菌属（表2），其中61个Reads数为杜氏假丝酵母，identity为99%~%。CSF(1、3)β-D-glucan化验结果是pg/mL，而血清(1、3)β-Dglucan试验多次表现为正常水平。重复的CSF18SrRNA和16SrRNAPCR检测结果均为阴性。患者接受联合抗真菌治疗，临床症状轻微改善，脑脊液形态恢复正常，MRI检测软脑膜增强减少。在先前报告的3例被诊断为杜氏假丝酵母脑膜炎的患者中，2例有注射用药史。

图3.参与者1、2、7的神经影像图

7、试剂和环境污染物背景特征

对24个水对照样本和96例非感染性脑脊液样本的mNGS比对结果显示，检测到个独特的细菌、病毒和真核生物属，这一微生物背景特征被一致比例(70%)的细菌类群所主导，主要是变形菌门和放线菌门，它们代表了之前作为实验室和试剂污染物报告的常见土壤、皮肤和环境菌群。

研究结论

本研究显示CSFmNGS检测能够克服常规CNS传染病诊断的一些限制：

??首先，脑或脑膜活检存在一定的风险，而脑脊液mNGS成为疑似中枢神经系统感染患者特别有吸引力且侵入性较小的诊断选择。

??其次，大量的神经侵袭性病原体均可导致亚急性或慢性脑膜炎，而靶向性的检测手段对临床医生的预判能力要求很高，且若进行多种靶向性检测则会造成高昂的成本。而mNGS具有无靶向性，一次性检测所有病原体的优势。

??第三，一些化验在免疫受损或急性感染的情况下缺乏敏感性（例如，西尼罗河病毒血清学），且诊断周期很长（例如，分枝杆菌和真菌培养），或者可能无法区分主动感染和先前接触（例如，结核囊虫病抗体或干扰素释放试验）。

在诊断困难的亚急性或慢性脑膜炎患者的脑脊液中，通过mNGS鉴定出多种微生物病原体，包括1例蛛网膜下腔神经囊虫病，该患者的诊断时间长达1年；另外本研究报道了第一例由米曲霉引起的CNS血管炎以及第四例杜氏假丝酵母脑膜炎。更重要的是，该研究建立了基于z分数的评分算法，使用该计分算法对宏基因组学数据进行优先排序可大大排除背景菌等污染问题。但后续还需要进行大量的前瞻性研究来确定这种方法的临床实用性，以减少假阳性的情况。

亮点

该研究介绍了利用mNGS检测，在7例具有诊断难度的亚急性或慢性脑膜炎病例中鉴定了病原体。同时利用仅含水的对照样品以及非感染性神经炎性综合征患者样本的mNGS数据建立了一个基于z分数的评分算法，用于区分真正的病原体和样品污染微生物序列，提高mNGS的准确率。

公司介绍

上海锐翌生物科技有限公司成立于年10月，是一家专业从事基因科技及健康服务的国家高新技术企业。锐翌生物依托高通量测序技术平台，专注于人体微生物组前沿技术和研究成果在基础科研领域的突破，以及在医学上的转化应用。助力高等院校、医院的科研工作者多角度、全面地探究和解决科学问题，助力更多优质科研成果发表。同时，在大肠癌早期筛查、临床病原宏基因组检测和健康管理等精准医疗领域开发检测技术及应用方案，致力于为医疗机构提供疾病早期检测和健康综合管理服务，目前已和全国医院达成深度合作。

公司于年获评“上海闵行十大科技创业新锐”企业称号，目前已在杭州、青岛、济南、贵阳等地成立区域中心。其中，济南医学检验所于年被授予“国家基因检测技术应用示范中心”称号，青岛医学检验所于年9月投入使用。

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